For bedre å forstå hvilken funksjon de ekstracellulære vesiklene har i cellekommunikasjon er det nødvendig å isolere dem fra øvrig kroppsvæske og karakterisere dem i detalj. Dette har Eduarda Guerreiro, ved Institutt for oral biologi, fokusert på i sin avhandling.
I tillegg har hun analysert proteininnholdet i vesiklene.
Arbeidet hennes kan på sikt ha betydning for å forbedre diagnostisering av pasienter med kreftsykdom og med den autoimmune sykdommen Sjögrens syndrom, der kroppens immunforsvar bl.a. angriper spyttkjertler og tårekjertler, som kan føre til tørr munn og tørre øyne.
Proteininnhold i ekstracellulære vesikler
Hva har du forsket på?
– Målet med min PhD-avhandling var å isolere og studere innholdet av proteiner i ekstracellulære vesikler. Jeg isolerte vesikler fra ulike kreftcellelinjer, inkludert munnhulekreft samt vesikler fra et klinisk materiale bestående av spytt (saliva) og tårer fra pasienter med Sjögrens syndrom.
Utviklet egen metode
Hvordan gikk du fram for å isolere de ekstracellulære vesiklene?
– Det er viktig å få isolert mange nok vesikler for å kunne utføre tilstrekkelig antall analyser av disse. Derfor utviklet jeg en metode som muliggjorde dyrking av store mengder kreftceller i laboratoriet. Dermed sikret jeg at antallet kreftceller var høyt nok til at de kunne produsere et stort antall vesikler. I cellekulturer finnes mange proteiner i tillegg til de ekstracellulære vesiklene.
For å få isolert de ekstracellulære vesiklene fra proteinene i cellekulturen, brukte jeg en kombinasjon av ultrafiltrering (UF) og size exclusion chromatography (SEC). UF ble utført for å redusere volumet av cellekulturen slik at dette ble ideelt for SEC-filtrasjonen. Ved hjelp av SEC ble partiklene i cellekulturen isolert etter størrelse. Siden de ekstracellulære vesiklene er større enn de oppløselige proteinene i cellekulturen, klarte jeg å skille dem fra hverandre ved hjelp av SEC.
Hvordan gikk du fram for å utforske proteininnhold i de ekstracellulære vesiklene?
– Analysen av proteininnholdet i de ekstracellulære vesiklene som ble isolert fra kreftcellelinjer og spytt og tårer ble utført ved hjelp av væskekromatografi-massespektrometri. I tillegg brukte jeg flere IT- verktøy for å trekke ut den biologiske betydningen av de omfattende datamengdene.
Frigjorde blærer med karakteristisk proteinprofil
Hvilke resultater kom du fram til?
– Metoden jeg utviklet gir et høyt antall ekstracellulære vesikler sammenlignet med antallet som fremstilles med konvensjonell celledyrkning.
Analysen av proteininnholdet viste at hver kreftcellelinje frigjorde ekstracellulære vesikler med en karakteristisk proteinprofil. I tillegg fant jeg at vesiklene inneholdt proteiner forbundet med kreftutvikling, kreftcelledeling og bevegelse av kreftceller.
Analysen av proteiner i Sjögrens-studien avslørte at de ekstracellulære vesiklene fra pasienter med primær Sjögrens syndrom har en proteinprofil som er ulik personer som også er munntørre, men som ikke har Sjögrens syndrom samt friske kontroller.
Har betydning for fremtidig diagnostikk
Hvorfor er forskningen du har gjort viktig?
– Metoden jeg har utviklet gir et tilstrekkelig antall vesikler til å kunne utføre ulike analyser eller forsøk med disse. Metoden er relativt enkel og krever ikke avansert utstyr. I tillegg er den stabil, reproduserbar og uavhengig av type kreftcellelinje som dyrkes.
Den karakteristiske proteinprofilen jeg fant i vesikler fra hver enkelt kreftcellelinje kan man kanskje benytte i fremtidig kreftdiagnostikk.
Proteinprofilen i vesikler fra pasienter med Sjögrens syndrom kan i fremtiden kanskje benyttes som et diagnostisk verktøy for å skille mellom Sjögrens-pasienter og andre pasienter med tørr munn, men som ikke har Sjögrens syndrom.
Referanser
- Aqrawi, Lara Adnan; Galtung, Hilde; Guerreiro, Eduarda; Øvstebø, Reidun; Thiede, Bernd; Utheim, Tor Paaske; Chen, Xiangjun; Utheim, Øygunn Aass; Palm, Øyvind; Skarstein, Kathrine; Jensen, Janicke Liaaen. Proteomic and histopathological characterisation of sicca subjects and primary Sjögren’s syndrome patients reveals promising tear, saliva and extracellular vesicle disease biomarkers. Arthritis Research & Therapy 2019; Volum 21. ISSN 1478-6354.s 1 - 14.s doi: 10.1186/s13075-019-1961-4.
- Guerreiro, Eduarda; Vestad, Beate; Steffensen, Lilly Alice; Aass, Hans Christian Dalsbotten; Saeed, Muhammad; Øvstebø, Reidun; Costea, Daniela Elena; Galtung, Hilde; Søland, Tine Merete. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLOS ONE 2018; Volum 13:e0204276 (9). ISSN 1932-6203.s 1 - 17.s doi: 10.1371/journal.pone.0204276.
- Aqrawi, Lara Adnan; Galtung, Hilde; Vestad, Beate; Øvstebø, Reidun; Thiede, Bernd; Rusthen, Shermin; Young, Alix; Guerreiro, Eduarda; Utheim, Tor Paaske; Chen, Xiangjun; Utheim, Øygunn Aass; Palm, Øyvind; Jensen, Janicke Liaaen. Identification of potential saliva and tear biomarkers in primary Sjögren’s syndrome, utilising the extraction of extracellular vesicles and proteomics analysis. Arthritis Research & Therapy 2017; Volum 19 (1). ISSN 1478-6354.s doi: 10.1186/s13075-017-1228-x.
- Hovedveileder førsteamanuensis Tine Merete Søland, Institutt for oral biologi, Universitetet i Oslo